活性氧诱导的氧化应激在慢性炎症疾病中起重要作用。由于它容易耗尽内源性抗氧化剂，破坏细胞的各种结构，从而加速细胞衰老，抗氧化补充策略已被用于治疗氧化应激相关疾病和延缓衰老的有效解决方案。

平均血清总抗氧化能力表明机体减轻氧化应激的能力。此外，血清总抗氧化能力的减少通常与各种疾病有关。在多发性硬化症患者中，急性冠脉综合征,或代谢综合征，血清总抗氧化能力明显低于健康人。一项荟萃分析也表明，老年痴呆症患者血浆中抗氧化剂的水平明显较低与健康的老年人相比因此，增加血清总抗氧化能力可改善健康和预防疾病。

最近的研究认为，氢气是一种具有抗氧化性能的新型医用气体。大量实验和临床研究表明，氢可以通过清除活性氧来保护细胞、组织和器官免受氧化应激诱导的损伤。富氢水也能提高人牙龈成纤维细胞的抗氧化能力。电解富氢水对人体也有好处，包括预防代谢综合征的发展，改善脂质代谢，抗炎症作用，减轻氧化癌治疗的副作用，自主神经功能的改善。

氢气使用方法有氢气吸入和饮用氢水等。活细胞不断产生活性氧，由于富氢水缓解氧化应激的特性，炎症、应激和许多疾病(如肿瘤发生)产生的过量活性氧可被氢分子减少。因此，相关症状会减轻。在一种新开发的仪器中，在正常一对正极/阳极上添加一个大电极，命名为Lita Life Ver. 2，可通过电解产生富氢水，电极表面的微观非凹凸镀金或释放的铂离子被水化形成胶体纳米气泡，气泡吸附氢分子，稳定时间更长。因此，即使经过10分钟的沸腾和随后的自然冷却，氢气仍会大量溶解在水中。

在之前研究中，自来水被认为适合制作高质量的富氢水(高溶解氢[DH])和低氧化还原电位。在本研究中，我们研究了纳米氢水浴的物理性质，找到最佳条件维持高浓度的氢在温水和纳米气泡，观察短期、中期和长期受试者用富含氢水浴对氧自由基吸收能力(ORAC)的抗氧化能力和c反应蛋白(CRP)水平和炎症症状改变。

Tanaka Y, Xiao L, Miwa N. Hydrogen-rich bath with nano-sized bubbles improves antioxidant capacity based on oxygen radical absorbing and inflammation levels in human serum. Med Gas Res 2022;12:91-9

一、受试者和试验方法

氢水浴的准备

通过电解产生氢气泡的氢水发电机Lita Life Ver. 2(日本大阪Lita Heart国际有限公司)(图1)根据制造商的规程使用了A。该装置由三个电极叶片组成，以电源为主体(图1)B.将200 L的温水(40°C)倒入浴缸中电解，产生含有气态氢的纳米级气泡。洗澡水电解60分钟，紧接着受试者洗浴10分钟。为了测量氢水的耐热性，将水在电解后煮沸2分钟，然后自然冷却3小时，直到达到室温。

 

图1:制氢-制水装置电极，工作状态及电极结构图。注:(A)当仪器正在运行时，宏观可见的气泡从电极冒出。(B)三刀片组成，晶格状，镀铂电极。

用电解装置测量氢水的性能

在电解60分钟后，利用sCMOS显微镜/摄像机以大约20万倍的放大倍数和每秒25帧的速度记录下氢泡形成过程。

使用Nano Sight LM10V-HS系统分析在不同时间点获得的水样。聚苯乙烯乳胶颗粒的水溶液作为标准颗粒。使用纳米颗粒跟踪分析软件分析纳米气泡的大小、频率分布和数量。每个样品测试五次。

用带有DH选择电极的极谱膜片式装置(DH计，根据我们之前的研究检测水中的DH浓度。对照组使用未电解的普通自来水(40°C, 200 L)。溶解氧(DO)浓度测定采用极谱DO仪DO- 5519e。

从健康和疾病志愿者中采集血清

2015年9月至11月，大阪府氢能医学协会通过互联网开展了健康和疾病志愿者招募工作。本研究符合日本厚生劳动省临床研究伦理指南。(图2)显示健康与疾病志愿者在这项工作中的分析流程图。这项工作由下列三个个案研究组成。

 

图2:健康与疾病志愿者分析流程图。

注:为分析氢水浴短期(5天)效果，将6名健康受试者分为3名对照(常规水浴)和3名氢水(富氢水浴)。测量ORAC和CRP。为分析氢水浴的中期(9天- 4个月)效果，3例患病女性使用氢水浴，并测定CRP。为分析氢水浴液长期(4个月- 2年1个月)效果，1例患病男性和5例患病女性使用氢水浴液，并测量CRP。其中一名女性的手和一名男性的腹部气孔被拍照。CRP: c反应蛋白。

氢水沐浴的短期效果。6名健康志愿者根据病例报告的水平随机分为两组:对照组(n = 3，常规自来水浴，40°C, 10分钟沐浴)和氢水组(n = 3，富氢水浴，40°C, 10分钟沐浴)。每组有2男1女，年龄在40-70岁之间。在检查前5天和检查期间，所有6名受试者均无任何慢性疾病，也没有服用特定的抗氧化营养品和过度运动。既往选取6例经确认体重指数正常范围(20.0-24.9 kg/m)的受试者2)和腰围(男性平均85厘米，女性平均90厘米)，详见日本厚生劳动省网站。每个志愿者的指尖立即用一次性穿刺针在以下时间周期内获得血液：沐浴前、沐浴结束后(0分钟)、沐浴后10、30、60和120分钟。血液3000 r/min, 4℃离心10 min，取上清作为血清。血清样本稀释后，进行ORAC和CRP酶联免疫吸附试验测定含量。

为了检验富氢水浴的中期效果，选取结缔组织病3例，胶原病1例(60岁)，根据2012年风湿性多肌痛症暂行分类标准诊断1例(60岁)纳入本研究。为了检验富氢水浴的中期效果，他们被要求每天洗10分钟的氢水浴，持续9天。9天到4个月的不同持续时间是根据他们对氢水使用期间的愿望和改善CRP值来确定的。然后在上述检查期之前和之后采集他们的血清样本。

在研究富氢水浴的长期影响时，6名受试者包括:(1)68岁男性急性主动脉夹层和灌肠;(2) 42岁，女性，膀胱癌及肾盂肾炎患者;(3) 60岁，女性，患有胶原病和皮肌炎;(4)女性，60岁，患有风湿性多肌痛;(5) 73岁女性，风湿性关节炎，左肩锁骨骨折;(6) 54岁女性，患有风湿性多肌痛症。此外，对两名受试者(受试者1和受试者3)进行了影像学检查。他们被要求每天洗一次氢水浴，每次10分钟，这些时间是自愿的，以改善CRP值为参考。

本研究经日本抗衰老医学科学中心伦理委员会批准(批准号:2019年1月15日，H-15-03-2;额外的文件1），该中心是一家经日本广岛县政府正式认证的非营利性机构，所有受试者提供了他们签署的知情同意书(2)附加文件在该批准明确规定，该研究将是非侵入性的(如无出血、无痛、无物理痕迹/体征)，并将使用商业上可用的仪器执行。

氧自由基吸收试验ORAC

本研究中进行的ORAC测定与之前的研究一样。ORAC活性测定试剂盒购自Cell Biolabs公司。反应按照修改后的制造商方案进行。以水溶性维生素E类似物TroloxTM为抗氧化标准品。简单地说，血清样本在超纯净水中稀释100倍。样品(25 μL)或标准品(25个加入微孔板孔中。2,2 ' -偶氮唑二盐酸盐溶液(25 μL;12 mM终浓度)和荧光素(150 μL;反应前立即混合终浓度为70 nM的溶液，用多通道吸管立即加入孔中。立即将极板置于荧光微板阅读器中，在37°C条件下每5分钟记录一次荧光强度，持续90分钟，激发波长为480 nm，发射波长为520 nm。用磷酸盐缓冲液代替样品溶液，用TroloxTM(2.5、5、10、25、50和100 μM终浓度)作为标准抗氧化剂配制6种校准溶液。

c反应蛋白测定

为了确定受试者的CRP水平，使用市售CRP对受试者的血清样本进行校准。然后将血清样本稀释至标准曲线范围内的预期浓度。与第一、二抗和链霉亲和素hrp检测液的反应按照厂家说明书进行。使用终止液停止反应，并使用荧光微孔板读卡器读取450nm处的吸光度。

统计分析

在合理的要求下，可以从通讯作者获得本次研究中分析的数据集。本研究的统计方法由大阪府立大学生物统计学家进行回顾。统计分析与上次报告类似。

 

二、研究结果 

用电解装置制备氢水的性能

电解后的性能，如氢纳米气泡的浓度、大小和动力学，因机械制造商和设备的型号以及电解条件(如温度和水的硬度)而异。因此，在不同的电解槽中，我们选择了一个由三个晶格状和镀铂电极叶片组成的电解槽，并研究了纳米气泡富氢水的物理性质。研究了通过电解产生的温热自来水和氢水中纳米气泡的产生和消失(图3)．电解前的自来水中纳米气泡很少，电解后，除了肉眼可见的乳白色或浑浊的宏观气泡外，氢纳米气泡不断出现。然后，在电解前测量纳米气泡的数量和分布:在200 l的浴缸中电解30、60和120分钟的洗澡水(40°C)。电解后，将水煮沸2分钟，然后冷却3小时。(图4)显示原始数据和(图5)A表示从原始数据中提取的平均纳米气泡大小的变化(图4)． 电解时间越长，纳米气泡浓度越高，在电解60分钟时达到峰值;然而，在120分钟时观察到轻微的收缩(图5)A.认为增加的气泡数量主要为氢纳米气泡所占据;因此，研究了电解时间对纳米气泡数量和DH浓度之间的关系(图5)B.在预电解水中，DH几乎为零，存在少量纳米气泡。随着电解时间的延长，纳米气泡的数量和DH呈线性增加，说明电解制备的纳米气泡主要由氢组成。最后，考虑到溶解氧的剧烈变化可能影响纳米氢气泡的抗氧化活性，测量了洗浴水中溶解氧的浓度。但随着电解时间的延长，溶解氧逐渐减少(图5)这种变化可能发生，因为电解产生的氢中和了氧气，或者溶解的氧气可能已经蒸发到大气中，超过饱和的水溶解度保留。

 

 

图3:电解热水和氢水中纳米气泡。

注:电解前的自来水只有很少的纳米气泡(左上)，而电解60分钟后，由于激光诱导的光晕在显微镜/摄像机下，氢纳米气泡不断出现并可被检测到(其他三幅图)。比例尺:1 μm。

 

图4:电解水纳米气泡的浓度和尺寸分布。

注:40°C的洗澡水是在一个200 升的浴缸中电解的。采用基于激光诱导散射光跟踪的Nano-Sight分析方法对电解前/电解后增加的气泡进行了评估，将其视为氢纳米气泡。

 

图5:电解装置产生氢水的性质。

注:(A)测量平均气泡大小对电解时间的依赖关系。洗澡水的制备方法与[图4]相同。(B) 30分钟(~150 μg/L)、60分钟(~250 μg/L)和120分钟(~400 μg/L)后纳米气泡数量与溶解氢浓度的关系。(C)测量溶解氧浓度随电解时间的变化。(D)纳米氢泡浓度的时间历程及仪器对比。采用Lita Life Ver. 2等仪器(A、B公司制造)连续测量纳米氢气泡浓度。数据以均数±标准差表示，并用Student’s进行分析t以及。

确定了制备纳米氢气泡的最佳条件，纳米气泡浓度的时间过程，以及几种电解仪器的比较。

用Lita Life仪器连续测量纳米氢气泡的浓度。为了比较，我们使用了其他的电解仪器(A公司和B公司制造)并进行了评价(图5)D. Lita Life比A和b仪器的氢浓度增加更快。Lita Life仪器在电解开始后30、45、60分钟故意停止电解。停止30分钟后，氢浓度(约340 μg/mL)维持2小时。停止45分钟和60分钟后，氢的最终浓度随着电解时间的延长而增加(分别为590 μg/mL和690 μg/mL)，而停止电解30分钟后，氢的最终浓度下降，并维持了近2小时(图5)因此，60分钟的电解和50- 80分钟的浴液被认为是最有利于产生和管理高浓度的纳米氢气泡的条件。

氢分子本质上是两亲性的，气泡的大小在100纳米左右(图5)A小于平均细胞大小的1%。因此，它们能够很容易地穿过细胞膜。纳米气泡的密度为0.7-0.9亿/mL，电解30 - 60分钟(图4)和(图5)B和一个气泡大约包含1.2万个氢分子/毫升。活细胞不断产生活性氧。过量的活性氧可能由一些物理危害产生，如炎症、应激和许多病理事件(如肿瘤发生)，活性氧和危害都可以通过氢分子减少。因此，纳米氢气泡可以减轻疾病症状。

短期氢水浴提高健康人血清抗氧化活性，降低CRP水平。

研究富氢水浴对人血清过氧自由基(ROO·)清除活性(ORAC能力)和CRP水平的短期影响(图6)和(图7)． 在对照组中，三名受试者在正常水浴后ORAC出现轻微变化(图6)a .相比之下，氢水组的三个受试者在洗10分钟氢水后ORAC迅速增加(图6)在30和60分钟时，与氢水镀液前的值相比，增加显著(图6)C.洗60分钟氢水浴的受试者和洗超过120分钟氢水浴的两名受试者的结果继续增加(图6)B.虽然两组间无显著差异，但氢水组ORAC容量明显增加(图6)C，意思是富氢水浴诱导人血清中抗活性氧活性。

 

图6:富氢水浴对人血清抗氧化能力(ORAC)的影响

注:(A)对照组ORAC值的时间进程(n = 3，常规自来水浴，40°C，浴10分钟)。(B) 氢水组ORAC值的时间进程(n = 3，富氢水浴，40°C，浴10分钟)。(C)对照组(n = 3)和氢水组(n = 3) ORAC值的时间进程用均数±标准差表示，并用Student’s进行分析t以及。

 

CRP是人体内炎症变化的标志。当氧化应激发生时，CRP水平倾向于增加。健康志愿者对照组和氢水组CRP水平变化的时间过程见(图7)一个和(图7)B,分别。洗澡后0 - 120分钟，氢水组CRP水平低于对照组(图7)C，两组之间没有发现显著差异，但结果仍说明富氢水浴在人体组织中诱发了抗炎活性。

 

图7:短期富氢水浴对健康人血清中炎症指标c -反应蛋白(CRP)水平的影响。

注:(A)对照组CRP值的时间进程(n = 3，常规自来水浴，40°C，浴10分钟)。(B) 氢水组CRP值的时间进程(n = 3，富氢水浴，40°C，浴10分钟)。(C)对照组(n = 3)和氢水组(n = 3) CRP值的时间进程用均数±标准差表示，并用Student’s进行分析。

氢水浴对疾病患者血清CRP水平的中期影响。

人血清中高CRP水平不仅反映炎症程度，还反映其与各种疾病的关系，如肥胖和慢性心力衰竭。因此，研究富氢水浴对结缔组织病患者血清CRP水平的中期影响(图8)． 3例结缔组织病患者在检查前和检查后9天至4个月的血清样本。在三名受试者中，洗澡检查期间前后CRP率分别下降至24%、34%和3%。

 

图8:中期氢水浴对疾病患者血清CRP水平的影响

注:观察每日反复使用氢水浴对结缔组织病患者血清CRP水平的影响。3例患者在检查前和检查后9天至4个月的血清样本。CRP: c反应蛋白。

氢水浴对疾病患者血清CRP水平的长期影响

观察富氢水浴对人血清CRP水平的长期影响(图9)和(表1)． 6例受试者在富氢温水浴检查期前CRP均高于标准值(0.30 mg/dL);然而，检查后，他们的CRP值下降到低于标准值。因此，在6例患者中，氢水浴对CRP抑制的有益作用得到了认可，但由于多种难治性疾病严重影响患者的安全，除氢水浴外的常规治疗无法避免或暂停。因此，洗澡前平均5.31 (0.44-14.4)mg/dL的CRP值降低到平均0.24 (0.13-0.45)mg/dL，这是在标准值(低于0.30 mg/dL)，即使对于平均59.5(42-73)岁的具有多种自身免疫相关疾病的患者。检查周期平均为10个月16天(2-25个月)。

 

图9:长期每日使用富氢水(氢水)浴对结缔组织疾病患者血清中c -反应蛋白(CRP)水平的影响

注:氢水浴对6例人血清CRP水平的影响。在所有受试者中，CRP值下降到或接近标准值的上限(虚线显示为0.30 mg/dL)。

表1:富氢水(氢水)浴对人血清c -反应蛋白(CRP)水平的长期影响

总的来说，富氢水浴提高了6名在富氢温水水浴检查期前CRP值高于标准值(低于0.30 mg/dL)的受试者的炎症标志物CRP水平。

富氢水浴对病人皮肤外观的影响

还通过照相观察富氢水浴对患者皮肤外观的长期影响。所示(图10)，氢浴4个月后，受试者双手背部的突出炎症区域为胶原蛋白病和皮肌炎(表1)减少，内出血改善，没有使用任何药膏(图10)一个和(图10)B。(图10)C显示氢水浴对急性主动脉夹层和灌肠患者的影响(表1)． 氢水洗澡前，患者表现出炎症性皮肤症状，如腹部造口周围肿胀和发红(如图10]C中的“炎症”，上图)。但是，每天进行氢浴，用氢水浸泡双脚，用氢温水对气孔周围的皮肤进行1年5个月23天的抑制后，炎症症状在没有涂抹任何药膏的情况下得到了缓解(图10)C,降低照片)。

 

图10:长期氢水浴对cpr较高患者皮肤外观的影响

注:受试者左、右手背炎症突出区，为胶原蛋白病及皮肌炎(表1)轻微变小(A、B)。另一例急性主动脉剥离及灌肠患者的炎症症状(表1)氢水浴前(C，上照片，炎症)氢水浴后(C，下照片)炎症缓解。C中也有灌肠区和固定器树脂区。

 

三、讨论

据推测，富氢水浴时氢分子非常容易通过毛发毛孔、皮脂腺、皮肤汗孔渗透到血液中，使皮肤下毛细血管扩张，从而增加皮下血流。此外，由于纳米级的气泡很小，它们很容易通过血管壁渗透到血液中，同时伴随体循环和输送(图11)． 因此，对于其他抗氧化剂，富氢水浴被认为比口服和皮肤软膏更能促进血液中的抗氧化活性。

 

图11:富氢水浴的氧自由基吸收抗氧化能力增强，降低c反应蛋白(CRP)的抗炎活性。

注:在炎症和氧化应激下，天然的CRP五聚体可转化为CRP单体，并侵入血管引起炎症反应。通过富氢水浴，氢泡泡能迅速渗透到真皮并被血液吸收，与活性氧发生反应，保护细胞和组织免受炎症/氧化应激引起的损伤。

通过氢水浴，纳米氢泡泡可以快速渗透到真皮并被血液吸收，根据ORAC测定法的估计，氢水浴后提高血清抗氧化活性所需的时间短至30分钟(图6)，ORAC测定法可以合理地评估特定人群血清的时间依赖性变化。为了阐明血清抗氧化活性升高的过程，需要在时间过程中反复抽取更大的血样。由于氢分子是电中性和两亲性的，且分子质量非常小，可以很容易地穿透细胞和细胞器的细胞膜和胞内膜。因此，氢分子可分布在生物的血液和组织中。例如，据报道，在饮用富含氢的水后，健康成年人呼出的空气中的氢浓度在15分钟时达到峰值，并呈剂量依赖性。

同时，在炎症和氧化应激下，作为五聚体的原生CRP可以转化为单体CRP(图11)．近年来，除了以浊度免疫分析法为基础的常规CRP法灵敏度低至0.1 mg/mL以下，重点考虑以乳胶凝集免疫分析法/浊度法为基础的高灵敏度CRP法灵敏度高达0.04 ~ 0.01 mg/mL，因为除了急性炎症外，还可以预测心肌梗死和内部器官衰老的前兆。然后mCRP侵入血管，引起炎症反应和氧化应激，导致免疫细胞聚集、细胞因子释放和血管损伤，同时增加活性氧的生成。然而，一旦氢分子进入血液，它们会清除活性氧，保护细胞和组织免受炎症/氧化应激引起的损伤。大鼠的胃经导管强制注入富氢水后，血液中氢的浓度可在3分钟内上升。作为比较，本研究使用富氢水浴将氢分子传递给受试者。经氢浴10分钟后，血清orac基抗氧化能力可提高。这种增长持续了1个多小时。此外，氢水浴后2小时血清CRP水平开始降低。数据表明，在健康受试者中，氢分子可以快速穿过皮肤，被血液吸收，增加血清总抗氧化能力，从而降低炎症因子(图6)和(图7)． 与其他多种抗氧化剂相比，氢本身的还原作用可能要弱得多。然而，由于一定水平的活性氧作为许多生物过程的触发或传递信号至关重要，强抗氧化剂有时可能通过阻断活性氧产生有害影响。正如一项系统综述中提到的，合成抗氧化剂可能会增加死亡率。而在本研究中，我们的数据显示富氢水对血清总抗氧化能力的增加和CRP的降低有短期、中期和长期的影响。这可能有利于长期的健康维持，因此可以降低死亡率。

疾病患者之间难以实现中长期合作。因此，本研究的局限在于以个案研究结束。

本研究还显示，富氢水浴改善了各种活性氧相关疾病患者的皮肤外观。富氢水浴中丰富的DH清除活性氧的能力，帮助皮肤黑斑、色斑的淡化和缩小，改善肤质。据推测，含有黑斑色素和脂褐素的皮肤表皮层是通过氢激活的角质形成细胞的增殖从皮肤表面等污垢排出的，或被氢的美白能力还原漂白。此外，富氢水浴对其他组织和血液/毛细血管也有类似的影响。