细菌产氢气提高抗肿瘤免疫功能
通过细菌产生氢气，解决氢气难以在体内持续停留的困难，一直有学者进行这方面探索。2009年哈佛大学学者补充产氢气细菌预防肝脏炎症，后来更多学者利用正常肠道内产氢气菌，给小肠不消化碳水化合物，激活肠道内细菌产氢气的潜力。发现对某些疾病具有治疗作用。我们课题组也进行类似研究，利用乳果糖增加肠道细菌产氢气，预防脑缺血作用。日本学者有利用难消化淀粉饲料，实现预防代谢综合征的作用。最近有学者通过给动物补充光合作用产氢气菌，结合光照增加细菌产氢气，发现这种细菌产生的氢气能提高动物抗肿瘤免疫功能，这一策略为氢气预防癌症增加了新手段，也在氢气抗肿瘤作用方面增加了新证据。
作为自然界中最轻的气体，H2的生物效应引起了广泛的关注。早在1975年，Dole等人就发现H2可以抑制鳞状细胞癌[1]小鼠的肿瘤生长。H2具有生物还原特性，被发现在某些氧化应激和炎症疾病中具有良好的治疗作用。肿瘤细胞中ROS处于高度平衡状态。H2可以与ROS中的·OH[12]等剧毒自由基发生反应，破坏癌细胞中ROS的稳态平衡，引起氧化还原应激[13,14]。此外，与化学药物不同，H2是安全无毒的。因此，近年来氢疗法受到越来越多的关注。He等合成了一系列金属钯化合物，用于存储和生产用于肿瘤H2治疗的氢[17,18,19]。此外，利用肿瘤酸性微环境如Mg、Fe纳米颗粒作为还原剂来制氢的其他策略也被制备出来。然而，这些策略受到非生物相容性材料的限制，难以实现H2的长期释放。因此，制定新的长期制氢策略是提高氢治疗效果的关键。
近年来，利用细菌等微生物作为活载体和治疗疾病的药物受到了广泛关注。例如鼠伤寒S. typhimurium和梭状芽胞杆菌已广泛应用于肿瘤治疗。然而，上述细菌通常是有毒的，需要复杂的排毒程序。此外，应利用转基因技术构建释放工程菌的抗肿瘤药物。PSB是一种兼性厌氧细菌，可在光照和缺氧环境中繁殖。我们之前的工作是利用无毒的PSB作为低氧靶向光热剂用于肿瘤治疗[34]。更有趣的是，我们发现PSB在光合作用过程中会释放出H2作为产物。在光照射下，PSB的叶绿素和类胡萝卜素捕获光子并传递到光合系统。氢是由氢化酶和氮化酶[37]共同作用产生的。此外，我们之前的工作已经证明PSB作为一种天然细菌可以增加CD4+和CD8+ T淋巴细胞的浸润，从而刺激免疫反应[34]。因此，我们认为PSB具有良好的缺氧能力和光趋化性，是肿瘤缺氧情况下原位和长期产氢的良好“储氢容器”。
受此启发，本研究开发出具有长期释氢能力的PSB用于癌症治疗。PSB自主定位于缺氧区，在氙灯照射下连续释放氢气。H2扩散到细胞内，引起氧化应激，杀死肿瘤细胞。凋亡细胞释放抗原激活树突状细胞(dc)，刺激免疫反应。更有趣的是，由于化疗总是诱导PD-L1上调，诱导免疫逃逸，我们发现基于psb的治疗并没有诱导PD-L1表达增加，从而增强肿瘤的免疫治疗(图1)。因此，氢治疗与自激活免疫治疗相结合为癌症治疗提供了一种新的策略。
图1 原理图。研制出具有长期释氢能力的PSB，用于氢治疗和增强免疫治疗
对小鼠进行荧光成像以评估PSB的生物安全性。PSB用RhB标记后注射给小鼠。可见PSB主要分布在肿瘤部位保留，未向其他器官扩散。此外还验证了PSB的体内代谢。结果表明:第7天未观察到PSB的荧光。通过血液生化和血常规检测，证实PSB无毒。监测小鼠30天体重也表明其生物安全性。在证明其安全性后，研究H2在体内的治疗效果。建立MCF-7荷瘤小鼠模型(图4A)。荷瘤小鼠随机分为PBS、PBS + L、PSB、PSB + L组。每7 d注射一次，2 d光照一次，持续21 d。记录肿瘤图像(图4B)及其权重(图4C)。21 d内小鼠体重稳定增长。每2天记录肿瘤体积。如图4D所示，PSB + L组能明显抑制肿瘤生长。与PBS组比较，PSB组肿瘤体积略有减小。这可能是因为PSB会刺激免疫反应，从而抑制肿瘤生长。21 d后处死小鼠，取肿瘤组织及主要脏器进行H&E染色等组织学分析。如图4E所示，PSB组肿瘤细胞轻度受损。PSB + L组肿瘤细胞坏死较多，其余两组肿瘤细胞损伤较小。对主要脏器进行H&E染色，发现四组处理均未对主要脏器造成损伤。TUNEL结果也显示PSB + L引起更严重的癌细胞凋亡(图4F)。我们的研究结果表明，H2疗法对抑制癌细胞生长有良好的治疗效果。通过测量肿瘤组织中Caspase-3和细胞色素C (Cytochrome C, Cytc)的含量，发现PSB + L组的损伤含量明显高于PBS组。结果与前期实验结论一致，提示氢治疗可通过上调Caspase-3等凋亡蛋白引起细胞凋亡。
我们成功地将PSB作为一种微生物制氢剂用于肿瘤靶向制氢和免疫治疗。PSB在可见光下可以通过光合作用持续释放H2。结果表明，H2在体内外均有较好的治疗效果。有趣的是，由于PSB的存在，PD-L1的水平不会上调，这有助于增加免疫治疗，减少免疫逃逸。因此，氢疗法与自激活免疫疗法的结合为癌症治疗提供了一种新的策略。
Yan H, Fan M, Liu H, Xiao T, Han D, Che R, Zhang W, Zhou X, Wang J, Zhang C, Yang X, Zhang J, Li Z. Microbial hydrogen "manufactory" for enhanced gas therapy and self-activated immunotherapy via reduced immune escape. J Nanobiotechnology. 2022 Jun 15;20(1):280.
