氢气Silica抗癌作用研究
2007年Ohsawa等发现氢不仅具有抗氧化和抗凋亡作用，而且对氧化应激诱导的细胞凋亡具有预防作用，并具有清除细胞内羟基自由基的能力。此后，许多基础研究表明H2具有新型抗氧化剂的作用，广泛用于预防和治疗各种疾病。研究表明，无论是使用吸入H2气体还是口服H2水，H2仍是清除活性氧(ROS)的有效方法
近年来，肿瘤化疗由于其副作用的多样性，需要进一步提高其治疗效果。这些副作用降低了患者的生活质量，有时还会导致死亡。理想情况下，抗癌药物不会有任何严重的副作用，而且会有选择性的作用，最大限度地减少对周围正常细胞的毒性。
本研究研究了封氢二氧化硅(H2-Silica)，它是一种新型抗氧化剂和无害颗粒，与纳米二氧化硅和微量矿物混合。它由二氧化硅、柠檬酸钾、碳酸钾和硫酸镁组成。在抗氧化作用方面，氢气-二氧化硅与液体接触时会产生大量的氢，导致ros的中和。这种试剂有望防止衰老，治疗各种疾病，并进一步，如杀死癌细胞
本研究旨在探讨氢气-二氧化硅对人食管鳞癌(KYSE-70)细胞与正常人食管上皮细胞(HEEpiCs)相比是否具有抗癌和诱导凋亡的作用。此外，我们还检测了这两种细胞系的细胞迁移，以研究H2是否具有抑制癌细胞侵袭的能力，从而在体外对正常细胞起到选择性保护作用。
氢气二氧化硅的制备与应用
氢气二氧化硅是二氧化硅氢化物“微簇”，由中国台湾彰化县New-1-Ten-Rin公司通过日本抗衰老医学科学中心(日本广岛)供应。DMEM和EpiCM-2准备包含氢气-二氧化硅 10, 100, 300, 600, 900,和1200 ppm，分别应用于KYSE - 70细胞和HEEpiCs孵化48和96小时。
图2，结果来自于WST-8染色检测两种细胞系的细胞增殖和活力的实验。结果表明，氢气-硅在300、600和1200 ppm细胞活力下降 。硅氢气对KYSE-70细胞和HEEpiCs迁移的影响。
图3. 采用创伤愈合实验观察KYSE-70细胞在迁移过程中的形态变化。与对照组(0 ppm)相比，每个氢气-二氧化硅处理组的间隙闭合有差异。在48小时之后有显著变化，特别是在72和96小时。在0 ppm和10ppm组的96小时，间隙完全闭合(图3A)。结果表明，间隙闭合取决于不同浓度的氢气-二氧化硅。说明氢硅材料可抑制KYSE-70细胞的迁移。相反，如图3B所示，300ppm的氢气硅对HEEpiCs的迁移有促进作用。然而，600和1200 ppm并没有促进迁移。
Li Q, Tanaka Y, and Miwa N. (2017): Influence of hydrogen-occluding-silica on migration and apoptosis in human esophageal cells in vitro. Med Gas Res., 7(2):76-85.
在本研究中，我们使用了几种检测方法和方法来检测氢气-二氧化硅是否对体外KYSE-70细胞产生作用。使用WST-8实验，我们发现氢气-二氧化硅给药后48小时内对KYSE-70细胞的增殖有抑制作用。创面愈合实验也显示了各自对细胞迁移的抑制作用，这些作用反映了癌细胞的侵袭和转移此外，通过活化caspase-3和Bax/Bcl-2的比值实验，证实氢气-二氧化硅具有诱导和促进癌细胞凋亡的作用。
为了观察和比较抗癌治疗过程中发生在周围正常细胞的其他不良反应，我们还获得了HEEpiCs的实验数据。虽然对KYSE-70细胞有抑制作用，但只有高浓度(1200 ppm)的氢气-二氧化硅导致HEEpiCs明显凋亡。这些结果表明，氢气-二氧化硅对人类癌细胞有抑制作用，但只有高浓度的氢气-二氧化硅才会对正常的人类细胞产生细胞毒性作用。我们之前观察到，高压灭菌和脱氢的氢气-二氧化硅对人角质形成细胞HaCaT几乎没有显示出抗氧化和细胞保护作用，可能是通过二氧化硅微颗粒-细胞之间的接触造成的机械抑制。此外，在一定剂量的氢气-二氧化硅的作用下，细胞的增殖受到轻微的抑制，这种抑制作用在不同的细胞系之间是不同的。另一方面，我们不能排除二氧化硅本身或由于二氧化硅的加入而使介质的pH值发生变化的可能性。
自2007年Ohsawa等人的突破性论文发表以来，关于氢气或氢水的研究报道很多。然而，把癌症作为实验目标的研究很少。我们注意到，关第一篇于氢气对人类皮肤癌细胞可能的生物效应的论文发表于1975。近年来，氢水加某种抗氧化剂在体外对癌细胞有抑制作用的报道很少。
Saitoh等报道铂纳米胶体氢水可以抑制人舌癌细胞的菌落形成效率或菌落大小。Nakashima-Kamimura 等观察到吸入氢气可改善顺铂引起的死亡率和体重减轻，并在体内外减轻肾毒性。然而，在荷瘤小鼠体内外，氢并不影响顺铂对癌细胞的抗肿瘤活性。他们得出结论，在化疗期间，氢可以有效地减轻顺铂的副作用，从而提高患者的生活质量。Asada等也报道了氢水联合铂纳米胶体可降低Ehrlich腹水肿瘤细胞的增殖、收缩、固缩和髓裂。Runtuwene等研究了氢水联合5-氟尿嘧啶的抗癌作用。他们发现，氢水处理促进了细胞凋亡，导致磷酸化的AMP活化蛋白激酶、凋亡诱导因子和caspase-3在结肠26细胞中的表达显著增加。高浓度氢水比低浓度氢水具有更强的抗氧化和抗癌活性。
细胞迁移在各种生物现象中起着核心作用。如图2所示，氢气-二氧化硅对KYSE-70细胞有一定的抗增殖作用，特别是在治疗后的最初48小时。此外，氢气-二氧化硅对癌细胞迁移的抑制作用持续48小时以上。与72小时后的对照组相比，没有观察到明显的差异。此外，与对照组比较，观察了丝状伪足形成的抑制和划伤伤口的关闭。通过显微镜观察，氢气-二氧化硅可以抑制癌细胞的肥大等细胞过程。
本研究中使用的氢气-二氧化硅是一种氢化物基化合物，离子氢嵌入笼状二氧化硅基质间隙中。合成过程简单、高效，氢化物含量约为17% w/w，结果一致。报道了氢气-二氧化硅的ORP、pH、相对氢分数和1H -核磁共振(NMR)谱，表明其具有-750 mV.的显著还原电位然而，二氧化硅是一种有益健康、生物友好的化合物，具有清除和减少活性氧的能力。处于硅状态的二氧化硅，以及细二氧化硅，用于食品添加剂和化妆品，目前已得到日本厚生劳动省的批准。应该强调的是，本实验中使用的氢气-二氧化硅与晶体二氧化硅不同，晶体二氧化硅属于国际癌症研究机构(IARC)定义的第1组致癌物，根据定义第1类材料可以通过吸入粉尘对人类致癌，特别是某些天然沸石沉积物中的纤维成分。
Kato等人研究了氢气-二氧化硅对人类产生黑色素的色素细胞(HMV-II)的抗黑素作用，这些细胞受到了紫外线A (UVA)光暴露的氧化应激。UVA照射后，HMV-II细胞产生的黑色素比未处理的对照细胞多2.72倍。当HMV-II细胞在uva辐照前后分别用低浓度的氢气-二氧化硅处理时，与对照组细胞相比，黑色素的数量被抑制到12.20%。研究人员发现，即使在高浓度的100 - 1000ppm，细胞活力和凋亡也没有变化。我们的结果与Kato等人的报告一致。
结果表明，氢气-二氧化硅在KYSE-70细胞中具有抑制增殖、促进凋亡和阻止细胞迁移的作用，因此，氢气-二氧化硅可能通过其抗氧化作用成为一种潜在的肿瘤预防和抑制转移的治疗药物。
Piskounova等人报道氧化应激可以限制体内的远处转移。这可以解释我们实验中KYSE-70细胞的迁移随着氢气-二氧化硅浓度的增加而表现出显著的抑制趋势的现象(图3A)。
恶性细胞通常处于高代谢状态，因此其ROS水平高于正常细胞。为了维持这种快速的生长状态，恶性细胞必须保持生长因子通路的激活。这可以使肿瘤细胞吸收更多的营养，并增强细胞分裂信号。因此，这种状态必然导致线粒体、内质网和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶产生越来越多的ROS。科学家发现ROS主要通过信号调节而不是通过破坏染色体结构来促进癌症。
从我们的实验中得到的结果似乎表明，如果对维持高水平ROS的肿瘤细胞使用强效抗氧化剂，可能会引起敏化。相反，氢气-二氧化硅可能在维持低水平ROS的正常细胞中产生毒性作用。
如图3C所示，氢气-二氧化硅在低浓度下对HEEpiCs的迁移有温和的促进作用。这表明，许多生长因子信号通路通过磷酸化起作用，并通过去磷酸化结束，并通过停止去磷酸化保持一种准备开始的状态。ROS在磷酸化和去磷酸化调控中发挥重要作用。首先，生长因子如血小板源性生长因子和上皮性生长因子可以快速促进ROS的生成，主要是通过NADPH氧化酶途径。其次，ROS对于生长因子诱导的酪氨酸残基的自磷酸化很重要。
氢气-二氧化硅通过影响抗氧化酶对KYSE-70细胞表现出抗癌活性，可能导致H2O2积累，细胞周期阻滞在G2/M期，并通过死亡受体和线粒体凋亡途径导致凋亡细胞死亡。
氢气-二氧化硅处理后，两种细胞的Bax/Bcl-2比值存在差异。氢气-二氧化硅在高浓度(1200 ppm)下对癌细胞表现出抑制作用并诱导细胞凋亡。然而，即使在浓度为100,300,600ppm时，细胞活力或凋亡事件也没有明显变化。相比之下，正常细胞对氢气-二氧化硅的反应不同。研究发现，低或中等浓度(≤300ppm)的氢气-二氧化硅对正常细胞没有损伤。
对正常细胞施以高浓度(1200 ppm)可导致细胞活力下降，细胞凋亡诱导增加，细胞毒性增加。众所周知，诱导不必要的凋亡对正常细胞的生长和增殖是有害的。过于强大的抗氧化剂可能有助于消除癌细胞，但也会产生不良后果，比如通过细胞凋亡或坏死等机制对周围正常细胞产生细胞毒性作用。
本研究结果表明，氢气-二氧化硅对KYSE-70细胞均可促进细胞凋亡。然而对于HEEpiCs来说，这种影响并没有那么剧烈。考虑到氢气-二氧化硅处理后Bax/Bcl-2比值增加，这表明，氢气-二氧化硅有时可能通过非caspase途径或启动子-caspase跳过途径，而不是典型的效应子- caspase-3途径，来触发细胞死亡。也有可能活化的caspase-3会被其他蛋白酶降解。这一结果与我们之前的研究揭示的机制相同。
我们认为，本研究存在一些局限性，值得进一步研究。第一个是NBT试验的阴性结果。Ohsawa等3发现吸入H2气体选择性地还原了羟基自由基，并得出H2可能在体外或体内有效地保护细胞的结论。一般来说，羟基自由基被认为是ROS中最具细胞毒性的。本研究中出现阴性结果的原因是明确的，但我们将重点研究不同的H2给药方法，并打算在未来使用另一种ROS检测方法。
我们也希望在未来的研究中获得一些数据来解释细胞骨架与细胞凋亡之间的关系。此外，我们无法确认氢气-二氧化硅300ppm是否在0 - 96小时或96小时后对HEEpiCs产生增殖作用(图3C)。因此，我们将分析氢气-二氧化硅浓度超过300ppm的时间进程和其他浓度，以对人类成纤维细胞进行类似的研究。
最后，很明显，H2-二氧化硅颗粒不仅便于携带和储存，而且比氢气发生装置更安全，氢气发生装置价格昂贵，操作困难，有爆炸的可能性。氢气-二氧化硅以一定的方式输送氢气;因此，它将用于我们未来的研究中观察人类正常皮肤细胞的体外创面修复。
氢思语：氢气-二氧化硅不是很准确的表达，原文是H2-Silica
