公牛精子也能被氢气保护
摘要：目的：研究冷冻保存以及氢气（H₂）对精子质量特性、精子的代谢、氧化和抗氧化指标的影响。将用BioXcell稀释液稀释的精子、冷冻保存后的精子以及经H₂处理后冷冻保存的精子作为对照组进行研究。对所有组别的精子定性指标、自由基反应强度、抗氧化酶活性以及三磷酸腺苷（ATP）浓度进行了检测。结果发现，经H₂处理后冷冻保存的精子中脂质过氧化作用减弱，抗氧化活性增强。研究表明，经H₂处理后冷冻保存的精子中，二烯共轭物、三烯共轭物、丙二醛的含量降低，超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶的活性增强。在H₂的作用下，氧化过程的减弱伴随着精子中ATP浓度的增加。解冻后，与未使用H₂的组相比，在H₂作用下精子活力得到了显著的保持。因此，H₂在淬灭活性氧方面效果显著，从而在冷冻保存过程中保护精子免受氧化应激的影响。H₂的这些特性在低温下保护了精子，并确保了解冻后精子仍能保持较高的功能活性。
引言
冷冻保存的目的是保存有活力的精子并提高繁殖效率（帕里齐等人，2023）。冷冻保存可使精子处于代谢静止状态，并在需要时使用（赫扎维赫等人，2018）。这种方法在动物育种中尤其有价值，因为它能有效利用具有高繁殖能力和遗传价值的种公畜，同时降低动物感染性传播疾病的风险（孙等人，2020）。
尽管冷冻保存有诸多益处，但仍有相当数量的精子由于与冷冻相关的因素而丧失了生育能力（塔鲁达尔等人，2015）。
精子的质膜是最易受到冷冻损伤的主要结构（高和克里斯特，2020）。膜脂中含有大量的多不饱和脂肪酸，极易发生氧化反应（马塔-坎普扎诺等人，2012）。线粒体膜同样会暴露于活性自由基中，导致ATP储备耗尽（马德亚等人，2021）。
到目前为止，抗氧化剂已广泛应用于冷冻保存领域（巴赫马里等人，2020；巴纳斯等人，2024）。然而，尽管冷冻保护剂种类繁多，其效果仍有限，细胞存活率仅为40%-50%（沃森，2000）。
一种新的技术解决方案是在研究中使用氢气（H₂）。H₂作为一种具有治疗和预防作用的抗氧化剂，可通过选择性地还原细胞内的强氧化剂，如羟基自由基（OH⁻）和过氧亚硝酸盐（ONOO⁻），对氧化应激发挥细胞保护作用（大泽等人，2007）。
本研究的目的：探究在改变冷冻保存精子质量特性的背景下，H₂对精子氧化和代谢潜力的影响。
材料与方法
选用15头3岁龄的健壮公牛。本研究依据《动物权利普遍宣言》中规定的原则进行，并得到了下诺夫哥罗德国立农业大学兽医系当地伦理委员会的批准（2020年4月27日第10号协议）。
用无菌的BioXcell培养基（法国）稀释精子。然后进行最终稀释、包装和平衡处理（在4°C下放置3-4小时）。采用开放式颗粒法进行冷冻。一个开放式颗粒的剂量符合俄罗斯国家标准GOST 26030-2015，为0.2毫升。将精子冷冻7.5分钟，使其温度降至-145°C，然后将装有样品的容器放入液氮（-196°C）中。经过7天的隔离期后，使用标准技术对开放式颗粒冷冻的精液进行解冻。
通过用生理盐水洗涤并离心的方法，将精子从精浆中分离出来。
为了研究H₂对公牛精子的影响，使用了用氢水稀释的“BioXcell”。
溶液中H₂的浓度范围为1.2-1.5毫克/升。使用“人造卫星-3”设备（中国）进行H₂饱和处理。
实验分为三组。第一组为用BioXcell稀释液稀释的原精液；第二组为冷冻保存后的精子；第三组为经H₂处理后冷冻保存的精子。
使用SFA-500和Biola AFS-500精子分析仪（俄罗斯）评估精子的定性参数，包括精子总浓度、总活力百分比和直线运动百分比。
通过测定丙二醛（MDA）、二烯共轭物（DC）、三烯共轭物（TC）、席夫碱（SB）的浓度以及抗氧化酶——超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶的活性，来确定精子中自由基反应的强度。采用分光光度法测定SOD（西罗塔等人，2016）和过氧化氢酶的活性（杰柳金娜等人，2020）。采用分光光度法测定氧化过程的浓度（丹尼洛娃等人，2020），通过与硫代巴比妥酸反应测定MDA浓度（杰柳金娜等人，2017），通过无机磷酸盐含量采用非酶法测定ATP浓度（杰柳金娜等人，2023）。
将获得的实验数据计算为平均值（M）和平均误差（SEM）。使用Statistica 6.0和Microsoft Excel应用软件包进行数据的比较分析。采用夏皮罗-威尔克检验法对分布类型的假设进行检验。使用参数统计方法（经邦费罗尼校正的t检验）研究统计规律。差异的统计学显著性水平设定为p < 0.05。
结果
本研究表明，原精液中精子活力为82.51 ± 5.95%（表1）。冷冻保存后，经检测有活力的精子占71.15 ± 4.34%，而在冷冻保存前用H₂处理后，有活力精子的数量恢复到了第一组的水平。
原精液中，有活力精子的平均数量为3576 ± 617万/剂量，冷冻保存后，有活力精子的平均数量为2735 ± 516万/剂量。原精液中直线往复运动精子的比例为37.81 ± 1.69%，冷冻保存后，该指标下降了9.36%，为34.27 ± 1.17%。
在精子稀释液中添加H₂并随后进行冷冻，改变了解冻后细胞的功能状态，提高了细胞的活力。因此，解冻后精子活力提高了12%（p < 0.05），精子平均速度提高了9%（p < 0.05）。与未使用H₂进行冷冻保存的情况相比，在H₂作用下直线往复运动精子的比例增加了6.27%（p < 0.05）（表1）。
对氧化代谢水平的研究表明，冷冻保存后的精子（第二组）氧化过程增强。与原精液样本（第一组）相比，DC和TC的含量分别高出67%和52%（p < 0.05）。第二组中丙二醛的含量比第一组高出30%（表2）。使用H₂后，MDA、DC和SB的含量恢复到了第一组的水平。
对精子抗氧化系统功能活性的研究表明，在冷冻保存液中添加H₂后（第三组），精子中SOD和过氧化氢酶的活性显著增强（表3）。与原精液精子（第一组）相比，SOD和过氧化氢酶的活性分别提高了42%和74%（p < 0.05）。冷冻保存后（第二组）精子中SOD活性增加了28%，这可能是对细胞内脂质过氧化过程加剧的一种补偿反应，因为这种酶是首先参与抗氧化防御过程的。
对精子能量状态的研究表明，冷冻保存后的精子中ATP浓度低于原精液精子，从0.79 ± 0.09微摩尔/升降至0.28 ± 0.05微摩尔/升（表4）。使用H₂的精子中ATP含量约为未使用氢进行冷冻保存的精子的两倍（p < 0.05）。
结果分析表明，在冷冻保存过程中使用H₂时，精子的氧化过程减弱，抗氧化活性增强。同时，在冷冻保存过程中使用H₂还能观察到精子中ATP浓度的增加以及精子生育能力的提高。
表1 氢气对精子生育能力参数的影响，（平均值±平均误差）
指标 原精液精子（第一组） 冷冻保存后的精子（第二组） 经H₂处理后冷冻保存的精子（第三组）
活力，% 82.51 ± 3.95 71.15 ± 3.34 * 79.62 ± 3.60 △
直线往复运动，% 37.81 ± 1.69 34.27 ± 1.17 * 36.42 ± 1.02 △
有活力精子数量，百万/剂量 35.76 ± 2.17 27.35 ± 2.16* 33.71 ± 2.03 △
平均速度，微米/秒 85.62 ± 3.54 74.53 ± 2.48* 81.56 ± 3.52 △
*注：平均值±平均误差，“*”——与第一组相比有统计学显著差异，p < 0.05；“△”——冷冻保存后组间（第二组和第三组）有统计学显著差异，p < 0.05。
表2 氢气对精子脂质过氧化的影响，（平均值±平均误差）
指标 原精液精子（第一组） 冷冻保存后的精子（第二组） 经H₂处理后冷冻保存的精子（第三组）
MDA（纳摩尔/毫升） 0.61 ± 0.12 0.85 ± 0.14 * 0.56 ± 0.08 △
DC（光密度单位/毫克） 0.24 ± 0.04 0.40 ± 0.08 * 0.19 ± 0.03 △
TC（光密度单位/毫克） 0.58 ± 0.04 0.88 ± 0.11 * 0.27 ± 0.05 *,△
SB（光密度单位/毫克） 50.17 ± 4.87 61.21 ± 2.46 50.50 ± 7.02
*注：平均值±平均误差，“*”——与第一组相比有统计学显著差异，p < 0.05；“△”——冷冻保存后组间（第二组和第三组）有统计学显著差异，p < 0.05。
表3 氢气对精子抗氧化系统的影响，（平均值±平均误差）
指标 原精液精子（第一组） 冷冻保存后的精子（第二组） 经H₂处理后冷冻保存的精子（第三组）
过氧化氢酶，微摩尔/毫克 9.03 ± 0.76 8.48 ± 0.82 15.78 ± 0.71 *,△
SOD，单位/毫克蛋白 0.61 ± 0.08 0.78 ± 0.08 * 0.87 ± 0.08 *,△
*注：平均值±平均误差，“*”——与第一组相比有统计学显著差异，p < 0.05；“△”——冷冻保存后组间（第二组和第三组）有统计学显著差异，p < 0.05。
表4 氢气对精子中ATP含量的影响，（平均值±平均误差）
指标 原精液精子（第一组） 冷冻保存后的精子（第二组） 经H₂处理后冷冻保存的精子（第三组）
ATP含量，微摩尔/升 0.79 ± 0.09 0.28 ± 0.05 * 0.47 ± 0.04 *, △
*注：平均值±平均误差，“*”——与第一组相比有统计学显著差异，p < 0.05；“△”——冷冻保存后组间（第二组和第三组）有统计学显著差异，p < 0.05。
讨论
众所周知，在氧化过程中，首先会形成超氧阴离子自由基（O₂⁻）（芬克尔和霍尔布鲁克，2000；林和比尔，2006）。
在SOD和过氧化氢酶的作用下，O₂⁻会通过酶促反应转化为过氧化氢（H₂O₂），然后再转化为水分子（H₂O）。在Fe²⁺和Cu²⁺等具有催化活性的金属存在的情况下，H₂O₂会通过芬顿反应生成极具反应活性的OH⁻。O₂⁻与一氧化氮（NO⁻）反应会生成极具反应活性的氮物种过氧亚硝酸盐（ONOO⁻）（拉迪，2013）。OH⁻是通过直接反应或引发自由基链式反应导致生物分子氧化和降解的主要原因。
然而，细胞的氧化还原稳态是活性氧生成与抗氧化系统之间的一种微妙平衡（巴珊等人，2009；布鲁尔等人，2013）。如今，人们认为氧化应激可作为信号分子，调节广泛的生理功能（刘等人，2005；贝尔等人，2007）。研究表明，自由基在细胞信号传导中起着重要作用（柯林斯等人，2012）。
在这些情况下，抗氧化剂应减轻过度的氧化应激，但又不能破坏氧化还原稳态。H₂可能就是这样一种抗氧化剂。
H₂可减少OH⁻的数量。对OH⁻的选择性还原可以用OH⁻的显著氧化能力来解释。这意味着OH⁻的氧化性很强，甚至能与惰性的H₂发生反应，而O₂⁻、H₂O₂和NO⁻则得以保留，代谢氧化还原反应也不会受到影响（大泽等人，2007）。
此外，众所周知，冷冻和解冻会通过产生大量活性氧诱导氧化应激，最终导致细胞程序性死亡（施等人，2024）。研究表明，H₂具有抗凋亡作用，可通过刺激抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xL的表达（川村等人，2010），抑制包括半胱天冬酶3（孙等人，2009）、半胱天冬酶8（川村等人，2010）在内的促凋亡因子，以及抑制Bax在线粒体中的转位（寺崎等人，2011）来实现。
因此，H₂在冷冻保存过程中对精子起到了保护作用，既直接作用于氧化过程，又通过抑制各种细胞死亡途径间接发挥作用。
结论
因此，冷冻保存精子的功能状态在很大程度上取决于细胞内的抗氧化机制。在冷冻保存过程中使用H₂时，氧化过程减弱，抗氧化酶活性增强。在这种情况下，精子冷冻保存的主要任务不仅在于维持细胞的氧化状态，还在于维持必要的代谢过程，以保存有活力的精子，并使其在受精过程中能在雌性生殖道中继续存活。使用H₂后，ATP浓度增加，表明细胞内的能量过程得以维持。因此，在精子冷冻保存中使用H₂可被视为一种很有前景的策略。
