氢气通减轻创伤性脑损伤后肺损伤机制研究
方法
我们对小鼠进行控制性皮质撞击以构建TBI模型。在TBI前30分钟，给小鼠腹腔注射10 mg/kg的选择性NLRP3抑制剂MCC950。TBI小鼠分别在伤后1小时和6小时开始吸入2%氢气，每次60分钟。吸入氢气24小时后，提取组织并分析损伤相关变化。监测吸入后动脉和静脉中的氢气水平。通过H&E染色和TUNEL检测观察肺组织的组织病理学变化和细胞凋亡。测量支气管肺泡灌洗液（BALF）中的总蛋白、氧合指数、肺湿干重比和肺髓过氧化物酶（MPO）活性，以评估TBI诱导的肺损伤严重程度。通过蛋白质免疫印迹（Western blotting）和定量PCR检测肺组织中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-18和IL-1β的蛋白质和mRNA水平。通过免疫荧光和免疫组织化学染色观察NLRP3和Caspase-1的表达变化和分布状态。
结果
TBI后24小时的显著肺损伤通过2%氢气治疗得到明显缓解。TBI激活了NLRP3炎症小体，增加了NLRP3、ASC和caspase-1的水平，导致肺部IL-1β和IL-18分泌增加。阻断NLRP3可减轻TBI引起的肺损伤，且其与2%氢气联合使用比单独治疗提供了更好的保护作用。
结论
2%氢气可通过抑制NLRP3炎症小体激活，减轻炎症反应并抑制细胞凋亡，从而保护TBI诱导的肺损伤。
文献
Molecular hydrogen mitigates traumatic brain injury-induced lung injury via NLRP3 inflammasome inhibition. BMC Chem. 2025 May 22;19(1):138.
在TBI相关并发症中，继发性急性肺损伤是最常见且重要的并发症[1]。超过50%的单纯重度创伤性脑损伤（TBI）患者会发生急性肺损伤[2]。TBI常见的两种颅外并发症分别是急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）[3]。同时，肺损伤也可被视为TBI患者死亡率的关键预测因素，合并ARDS的TBI患者死亡率高达30-40%[4]。TBI后ALI或ARDS的主要危险因素包括肺炎、败血症和胃内容物误吸[5]。受损脑组织释放的炎症介质引发肺部的全身炎症反应，这是TBI后ALI的基本病因[6]。因此，减轻过度的肺部炎症对改善TBI患者的预后至关重要。
氢气（H₂）已在动物研究和临床试验中被报道可治疗多种疾病[7]。由于其独特的抗氧化和抗炎能力，氢气治疗被认为对一系列神经系统疾病具有潜在治疗价值，例如创伤性脑损伤、阿尔茨海默病、抑郁症、焦虑症、缺血性中风和多发性硬化症[8]。我们的研究表明，吸入2%氢气通过调节神经炎症、减少氧化应激和神经元凋亡，显著保护脓毒症小鼠的脑损伤和认知功能障碍[9]。此外，研究还发现氢气可通过减轻炎症和氧化应激，缓解脓毒症诱导的肺和肠损伤[10,11]。
NLRP3蛋白是一种胞质模式识别受体，有助于检测微生物基序、内源性危险信号和应激信号。一旦激活，NLRP3会组装多蛋白炎症小体复合物，激活Caspase-1酶并促进IL-1β和IL-18等促炎细胞因子的释放[12]。多项研究表明，抑制TBI后慢性NLRP3激活可通过调节神经炎症和防止细胞凋亡，预防长期脑功能障碍[13]。此外，研究发现吸入氢气可通过ROS/NLRP3轴减轻蛛网膜下腔出血（SAH）大鼠的炎症和氧化应激，有助于改善神经行为学结果[14]。
本研究旨在探讨氢气在减轻小鼠TBI诱导的急性肺损伤中的作用，并通过抑制NLRP3信号通路探讨其潜在治疗机制。
材料与方法
动物实验设计
雄性C57BL/6J小鼠（6-8周龄，20-25 g）购自中国北京军事医学科学院实验动物中心。所有实验均经中国天津环湖医院动物伦理与福利委员会批准。小鼠饲养于温度和湿度可控的环境中。根据伦理要求，使用七氟烷吸入对小鼠实施安乐死麻醉。
研究随机分为五个实验组：假手术组（sham）、TBI组、TBI+M组、TBI+H₂组和TBI+H₂+M组。实验设计和流程如图1A所示。选择性NLRP3抑制剂MCC950（美国Thermo公司）用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）溶解，配制成10 mg/ml的浓度。对于TBI+M组和TBI+H₂+M组，在TBI前30分钟腹腔注射10 mg/kg的MCC950。MCC950的剂量基于先前研究[15]选择。TBI+H₂组和TBI+H₂+M组的小鼠分别在TBI后1小时和6小时开始适应吸入2%氢气60分钟。
图1.
在创伤性脑损伤（TBI）或假手术术后1小时和6小时分别开始吸入2%氢气后，检测氢气浓度。
A 实验流程图。B-E 各组小鼠在吸入氢气开始后0、10、20、30、45、60分钟，以及吸入终止后5、15、30、45分钟时间点的动脉和静脉氢气浓度。数据以平均值±标准差表示（n=6）。*P<0.05与假手术组相比；※P<0.05与TBI组相比；#P<0.05与TBI+H₂组相比
实验1：检测各组小鼠动脉和静脉血中的氢气浓度（n=6）。通过小鼠股动脉和静脉穿刺置管，分别在开始吸入氢气后0、10、20、30、45、60分钟，以及吸入终止后5、15、30、45分钟采集动脉血和静脉血（每次10μL），检测氢气浓度[16]。分组方法同上。
实验2：测量支气管肺泡灌洗液（BALF）中的总蛋白、氧合指数、肺湿干重比和肺髓过氧化物酶（MPO）活性，以评估TBI诱导的肺损伤严重程度（n=6）。分组方法同上。
实验3：检测各组小鼠肺组织的病理变化和细胞凋亡，以确认吸入2%氢气对TBI小鼠的影响。将小鼠分组并给予相应处理，使用七氟烷麻醉，术后24小时采集肺组织（n=6）。组织用4%多聚甲醛固定24小时，石蜡包埋后切成5μm厚的切片进行染色。
实验4：将小鼠按上述方法分组并给予相应处理，术后24小时以相同方法采集肺组织，检测蛋白质和mRNA水平。通过蛋白质免疫印迹法（Western blotting）检测肺组织中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-18和IL-1β的蛋白质水平（n=3）。此外，通过定量PCR检测肺组织中上述基因的mRNA水平（n=5）。
实验5：使用上述制备的肺组织切片，通过免疫荧光和免疫组织化学染色观察NLRP3和Caspase-1的表达变化和分布状态（n=5）。
创伤性脑损伤模型构建
使用可控皮质撞击装置（Custom Design & Fabrication, Sandston, VA, USA）构建TBI模型[17]。小鼠首先用2%七氟烷麻醉，维持麻醉浓度1-2%。将小鼠固定于立体定位框架上，确保右眼与耳连线平行于水平面。在顶骨中线旁开2.0mm、冠状缝后2.0mm处行4.0mm颅骨切开术。可控皮质撞击器设置为撞击速度4.5m/s，停留时间200ms，穿透深度1.8mm。术后缝合头皮切口。
氢气吸入
通过TF-1气体流量计（YUTAKA Engineering Corp, Tokyo, Japan）向舱内通入氢气并与空气混合，平均流速4L/min。使用Hy Alerta手持式检测仪（型号500, Valencia, CA）持续监测氢气输入，维持治疗期间浓度稳定在2%。通过碱石灰去除舱内二氧化碳。
动静脉氢气浓度检测
使用氢气传感器（Unisense, Denmark）检测动静脉血中的氢气浓度。采血时间点如下：吸入氢气开始后0、10、20、30、45、60分钟，以及吸入终止后5、15、30、45分钟。
注：从氢气浓度分析看，吸入1小时很不够，一是吸入后迅速减少，二是氢气浓度没有达到平台稳定浓度，正在上升过程。这难以达到比较理想的剂量。当然也没有进行不同浓度的比较研究。
