引言

剧烈或长时间运动会导致疲劳，这是一种常见现象，会限制运动表现以及其他剧烈或长时间的活动。作为对肌肉收缩的反应，早期疲劳表现为力量或功率输出的下降，这并非病理性的1。然而，累积性疲劳会加剧多种病理状态，包括衰老和虚弱，以及神经病变、肌病和心血管疾病，最终损害人体健康2。根据运动通路的不同起源，疲劳可分为中枢性疲劳和外周性疲劳3。中枢性疲劳是指中枢神经元对肌肉的驱动减弱，而外周性疲劳是指在神经肌肉接头处或其远端发生的变化。在最大强度和高强度运动中，神经肌肉功能的变化主要发生在肌肉内⁴。外周性疲劳与代谢物、活性氧和活性氮的增加有关1˒3。然而，肌肉疲劳的确切机制尚未完全明确。

在过去几十年中，人们做出了大量努力来提高抗氧化能力，从而改善运动表现。人体的抗氧化防御系统包括酶类抗氧化剂（如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶）和非酶类抗氧化剂（包括维生素A、C、E、辅酶Q10和谷胱甘肽）⁵。在人类、啮齿动物和离体肌肉标本中，抗氧化剂（如生物活性肽和氨基酸、多糖和寡糖、酚类化合物、生物碱、类胡萝卜素、皂苷、维生素等）能有效延缓疲劳症状并缩短恢复时间⁶。尽管如此，抗氧化剂在应用时仍存在诸多弊端⁷˒⁸。首先，相当一部分有效证据来自动物实验，而关于给药剂量和持续时间的临床试验仍不充分。其次，由于训练类型、饮食习惯和氧化还原状态的差异，一种抗氧化剂很难持续对疲劳产生积极影响。第三，抗氧化剂的药效有限，过量使用甚至会诱发肝毒性。氢分子（H₂）除了具有较高的生物安全性外，还是一种很有前景的缓解运动诱导疲劳的候选物质。

先前的研究表明，吸入氢气⁹ˉ11、运动前饮用富氢水1⁰˒12、在高氢环境（补充2%氢气）中运动13，以及运动后氢浴或饮用富氢水1⁴ˉ1⁷，都能有效减轻肌肉疲劳。抗氧化和抗炎作用是氢气在包括疲劳在内的多种疾病中发挥保护作用的重要机制1⁸。此外，氢气还能刺激免疫系统、改善代谢平衡，从而促进身体疲劳的恢复1⁹˒2⁰。然而，氢气抗疲劳的分子机制仍不明确，特别是内源性抗氧化系统如何被调控。

转录因子核因子erythroid 2相关因子2（Nrf2，由NFE2L2基因编码）是细胞抵御氧化应激的核心调控因子。已有研究表明，在其他疾病中，氢气可诱导Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）/Nrf2抗氧化通路并改善线粒体功能21ˉ2⁵。运动可激活外周组织中的Nrf22⁶ˉ2⁹，但这种激活的确切机制尚未阐明。在氧化应激或其他刺激条件下，代谢微环境是激活Nrf2的重要刺激因素。

本研究假设，富氢水可上调免疫应答基因1（IRG1）和衣康酸的表达，通过刺激Nrf2/血红素加氧酶-1（HO-1）通路来减轻氧化应激，从而缓解疲劳。本研究为衣康酸与氢气抗疲劳作用之间的关联机制提供了新的见解。



方法

动物

为减少潜在的雌激素相关混杂效应，本研究使用雄性小鼠。21只8周龄雄性C57BL/6小鼠（购自上海杰思捷实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2024-004），体重18±2g，饲养于温度20-25°C、12小时光暗循环的笼具中，自由摄食饮水。实验结束后，通过颈椎脱臼法处死小鼠。实验过程遵循《实验动物护理和使用指南》3⁰，并经海军军医大学机构动物护理和使用委员会批准（批准号：NMUMREC-2021-006；2021年3月10日）。



疲劳模型建立与富氢水处理

将小鼠随机分为三组：对照组（Ctrl）、运动诱导疲劳组和富氢水组（每组n=7）。所有小鼠均饲喂正常饮食，但饮用不同的水。在4周的实验期间，对照组和运动诱导疲劳组小鼠自由饮用蒸馏水，富氢水组小鼠自由饮用由纳米气泡装置（上海Nanobab纳米科技有限公司）制备的富氢水（>1.5ppm）。为减少氢气损失，富氢水储存于铝袋中，每8小时更换一次31。实验流程如图1A所示。
 

图1: 

体内（A）和体外（B）实验流程图。4-OI：4-辛基衣康酸；Ctrl：对照；EF：运动诱导疲劳；H₂：氢气；HW：富氢水；IRG1-IN：免疫应答基因1抑制剂。



为达到过度训练的效果，常通过增加运动方案的负荷来建立游泳训练的运动诱导疲劳模型32⁻3⁷。因此，我们建立了为期4周的小鼠强迫游泳模型。具体而言，将运动诱导疲劳组和富氢水组的小鼠置于水箱（高30 cm、直径30 cm）中，水深20 cm，水温20-25°C。经过3天的适应性游泳（每日无负荷游泳1小时）后，小鼠每天被迫负重游泳1小时，负荷（体重的7.5%）附着在尾部近端。根据小鼠的身体状态适当调整游泳时间。若小鼠过度疲劳，下沉超过10秒且无法自主返回水面，则视为完成当日运动，当天暂停训练。